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慢病毒载体使用中的问题及解答(FAQ

 

1、对照病毒或目的病毒感染细胞以后,细胞形态发生改变或者细胞死亡,是否说明病毒有毒性?

 

RE首先,确定病毒是否有污染;

 

1)细菌污染    病毒用Millipore 0.22um滤器过滤去除细菌;

 

2)真菌污染    病毒直接丢弃

 

3)支原体污染  细胞间质有黑点,黑点运动状,寄送抗支原体试剂试用装

 

4)细胞碎片    感染后换液几次去除细胞碎片

 

其次,确定病毒感染MOI是否过高,梯度稀释后感染,寻找合适的MOI

 

同时考虑目的细胞可能比较敏感,更换其它细胞感染确定病毒是否有问题。病毒对某些敏感细胞有毒性可能是不可避免的。

 

如果以上都排除后细胞状态仍然不好,尝试增加血清含量,观察细胞状态是否好转。

 

 

 

2、病毒感染目的细胞感染不上或效率低?

 

RE:病毒感染效率和以下几个因素有关,

 

1)病毒活性   解冻病毒一定要在冰上进行,尽量避免反复冻融,冻融会影响病毒滴度。-80℃保存半年以上需要重新测滴度;

 

2)目的细胞   最好预实验测试过,看病毒载体是否合适感染目的细胞。一些难感染的细胞,如贴壁不好的细胞,原代细胞等,或者体内动物实验适合用腺病毒;

 

3 MOI     一般来说MOI都是要用梯度法来摸索的,不同的病毒感染不同的细胞的MOI值也不一样,如果感染细胞所用的病毒量不够的话,感染效果肯定不好;需要确认MOI计算及细胞计数的准确性。

 

4) 感染时间  慢病毒/逆转录病毒一般在感染后24h换液,感染后换液太早会导致感染效率下降;感染后换液太晚,则对细胞的损伤太大,效率也不高。感染后48h开始观察荧光,由于慢病毒的表达时间较长,有的72h120h才能看到荧光。

 

5)助转剂   polybrene是带正电的小分子,与细胞表面的阴离子结合,提高慢病毒对细胞的感染效率,通常polybrene的加入能提高感染效率的2-10倍。Polybrene有一定的细胞毒性,有的细胞对polybrene的毒理反映明显,因此细胞感染时是否添加polybrene需要摸索,不同细胞对polybrene的敏感度不同,可以用1-10ug/ml的范围筛选合适的浓度,24h内细胞无明显毒性反应为佳,可参考文献并进行预实验摸索。

 

6)荧光显微镜 确定荧光显微镜是否处于最佳状态。

 

PS:慢病毒带puromycin抗性的可以用嘌呤霉素筛选,也可提高阳性细胞率。

 

 

 

3、幸运彩票表达慢病毒载体比对照的荧光要暗?

 

       RE:每种病毒有自己的载体容量,基因的插入,会影响位于其下游的荧光蛋白等基因的表达。

 

对照病毒或干扰病毒,由于没有插基因或者插入基因非常短,荧光会强。而插入了较长基因之后,荧光的亮度会随着插入基因的长度以及特殊结构的存在等而减弱,尤其是出现高GC片段。由于影响了转录,荧光强度会大大降低。因此不能将过表达病毒的荧光和对照病毒荧光进行比较,荧光较弱不等同于病毒的滴度差。

PS:观察荧光时最好关掉室内灯光,只留荧光显微镜光源。

 

4、要曝光很长时间才能观察到荧光?

 

RE:要曝光很长时间才能观察到荧光,说明荧光比较弱,可能的原因有:

 

①显微镜汞灯使用时间长,这个可以通过对照排除,看是否有比较亮的对照,或者如果有其它比较亮的样品,证明不是汞灯的问题;

 

pH值低,看培养基是否发黄导致绿色荧光淬灭

 

③目的病毒光不亮 插入目的基因后的病毒荧光强度会相较对照弱一些,这个属于正常现象,曝光时间被对照稍加长些,看感染上的阳性细胞比例如何,同时感染一下对照,看看目的和对照的荧光的差异,如果感染比例尚可,差异不是很大,用purmycino筛选有大量细胞存活,则病毒也可以使用。

5QPCR有效果,但是WB效果不高/没有?

REQPCR有效,WB检测没有过表达的可能原因有:

1)跨膜蛋白,一般的裂解方法较难完全裂解,难检测到蛋白的表达。可推荐使用我们公司的裂解方法

2)检测标签表达,确认标签是否表达,标签是外源性的,更容易检测到。

3WB直接检测目的蛋白,受到抗体的质量(包括抗体有效性和灵敏度)操作等影响较大。另外,由于每个客户的目标基因,转染的细胞都不同,比如基因翻译受阻,或者出现代偿性上升/下调等都会导致WB检测不到。

 

6、过表达病毒感染后,QPCR没有过表达?

RE:首先应可通过荧光或筛选标记来判断感染效率,感染效率最好到50%以上。

第二,确认引物序列是否正确,平时碰到最多的情况,是客户用的引物为primerbank等数据库中查询的,引物位于基因的UTR区,而我们过表达病毒克隆的是ORF区,用这样的引物不能检测出来。也可以建议客户PCR的产品跑个电泳,看看PCR产物对不对。会不会是非特异性扩增。也可以看下引物的GC含量是否很高。

第三,如果以上两点均正确,那么检查一下QPCR的数据,包括溶解曲线是否80℃以上的单峰(80℃以下很多为引物二聚体峰),以及ct值的情况,复孔是否均匀,目的基因的ct值和内参的δct是多大,有些丰度很高的基因,本身内源性表达量就已经接近或者超过内参了,过表达量就比较难提升很高倍数(因为QPCR的过表达倍数是相对量,如果内源性低过表达倍数就会很高,如果内源高,过表达倍数就容易显低)。

 

7WB幸运彩票跟理论不同的解释:

RE:蛋白发生如磷酸化、糖基化等翻译后修饰时条带会上移,蛋白发生剪切(如前体)时条带会下移,蛋白存在不同的可变剪切体或亚型,强相互作用大分子存在时变性不彻底。

 

8、为什么做westernflag检测有过表达,用目的蛋白的抗体检测没有过表达?

RE:这种情况存在以下几种可能

① 两种抗体灵敏度不同

② 过表达量被本底表达掩盖(基因在细胞中本身有较高的内源性表达量,过表达之后用目的蛋白抗体WB检测到的条带比本底的浓度只大一点因此并不明显,如果上样浓度再有些不一致就会被掩盖掉。而flag抗体是有或无的区别,因此能明显看出来。)

ORF出现突变或移码,表达的不是目的蛋白。这个可以通过检查测序结果和对照flag抗体做出的条带大小来初步排除。测序结果没有突变,而flag检测到的蛋白和理论大小差不多,证明ORF能正常翻译,出现移码的可能性不大。

④ 基因有多个转录本,目的蛋白抗体只能检测到其中某一种或几种表达形式,检测不到过表达的这个转录本形式(可以查看一下抗体的抗原表位,看理论上是否能结合)。

 

9、做了3条干扰,下调效果不好(我们的干扰一般是保证70%的下调效率)?

RE

1)确认感染效率(如果客户没有用抗性筛过的话)。干扰和过表达不同,过表达可能有30%或者50%的感染率,就能有数倍的过表达(相对内源性表达是成倍提升)。但干扰的效率很大程度上决定于感染效率(假设siRNA的下调效率是80%,但只有50%的细胞感染上,那整体水平上来说,至多只有40%的下调效率)。

2)确认QPCR数据,

①先检查QPCR引物是否有问题,干扰的不需要在ORF区,但是我们设计的位置主要在CDS区,最好用CDS区的引物来检测,比对一下看种属基因是否正确。

②其次看溶解曲线峰图,是否平滑是否有杂峰,是否峰在80℃以下,如有以上情况可能PCR结果不准确。

③看CT值,复孔之间是否均一,因为干扰不像过表达好做,干扰对复孔均一性要求很高,如果复孔间误差超过1,计算后就会造成50%左右的下调误差,非常严重。除复孔均一性外,也要注意ct值大小,有些基因内源性表达极低,ct值接近或超过30,这种低表达的基因再去做下调,本身意义不大,属于前期实验设计问题,建议更换靶细胞。

3)如果qPCR下调效率达不到70%,达到50%左右对下游也可能有调控的,但是qPCR结果要有显著性。建议可以看一看后续实验有没有结果。

 

10RNA干扰:如果我的基因 设计了6条干扰序列都无效果,可能是什么原因?有什么解决办法吗?

RE

1)可以尝试用puromycin等筛选一下试一试;或者是过表达之后knockdown,看基因是不是有下调。

2)我们根据专业betway必威官网登录平台进行干扰靶点预测,理论上分值(即星级)越高,干扰效果越好,因此我们优先选择分值最高的三条序列进行构建。然而软件预测结果和实际的实验结果未必完全一致,如果6条都无效,很有可能该基因就不适合使用shRNA干扰方式进行敲减。

 

11siRNA幸运彩票,但是包成shRNA病毒后,下调效果变差,是不是基因没有包进去?

REsiRNAshRNA在结构上是不一样的,siRNA为化学合成,使用浓度一般为5uM,浓度非常大,瞬时转染时如果细胞转染效率尚可,瞬时进入细胞中的分子数非常多(超过8次方),并且不需要经过剪切加工过程就可以和靶点结合,因此非常容易起效果,1条有效的概率接近90%.

      shRNA不同,是将干扰基因克隆到DNA上,经过病毒整合(慢病毒)或者非整合(腺病毒,腺相关病毒)进入到细胞内后,经过转录,变成发夹RNA,再经过胞内一系列酶的剪切加工后,才能变成可以和靶点结合的干扰RNA。这个过程中因为拷贝数低(如慢病毒需要整合基因组),转录加工过程复杂,因此比较难起效果,即便同时做3条,也有约10%的可能性会出现3条干扰效率都低下的情况。另外,单从碱基数上来说,siRNA一般为19nt,而我们设计shRNA时,一般长度为21nt25nt,所以有效的siRNA,往往有可能会出现并不合适做成shRNA的情况。

 

12miRNA sponge 没有效果?

RE:确认感染效率,收样时间(一般48h能有效果)。mirRNA sponge作用机理为竞争性结合mirRNA,不会导致mirRNA降解,因此建议通过检测mirRNA作用靶点的方式验证mirRNA sponge的功能。

 

13、慢病毒筛选稳转株之后,培养一段时间检测没有过表达(干扰)效果?

 

RE:慢病毒感染细胞用puro筛选得到稳转株之后,需要一直用含有puro的培养基去培养细胞,以免出现基因丢失的情况。建议后期培养浓度可以按照1/10-1/2的筛选浓度来。

 

Chinese, Simplified
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