主页 RNA专用转染试剂说明幸运彩票

介绍:主页是一种功能强大的siRNA / miRNA转染试剂,可确保在哺乳动物细胞中进行有效的转染和基因沉默,并且具有高重复性的结果。在绝大多数的细胞(如HeLa,MCF7或NIH-3T3)中使用主页转染1 nM siRNA,就能达到超过90%的转染效率;对于难以转染的悬浮细胞系如K562或THP-1细胞,使用主页转染终浓度为5 nM的siRNA,也可以观察到超过80%的转染效率。

 

1、贴壁细胞转染siRNA操作步骤

1.1接种细胞

为了使用主页转染贴壁细胞取得最佳的转染效果,需要提前一天将细胞接种到相应的培养板中,以转染时细胞汇合度达到30-50%为宜。(推荐接种的细胞数量参见表1)

 

表1.转染前一天推荐接种的细胞数

培养板规格

接种细胞数量

 每孔表面积

  培养基体积

96-well

5 000 ± 2 500

0.3cm2

0.2 ml

24-well

25 000 ± 10 000

1.9 cm2

1 ml

12-well

50 000 ± 20 000

3.8 cm2

2 ml

6-well / 3.5 cm

150 000 ± 50 000

9.4 cm2

4 ml

6 cm 培养皿/25cm2培养瓶

400000 ± 100000

25 - 28 cm2

8 ml

10 cm培养皿 / 75 cm2培养瓶

1 x 106 ± 250 000

75 - 78.5 cm2

15 ml

14 cm培养皿 / 175 cm2培养瓶

2 x 106 - 5 x 106

153 - 175 cm2

20 ml

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1.2 贴壁细胞转染

为了达到高的基因沉默效率,我们建议siRNA浓度范围为1 nM至10 nM,因为最佳siRNA浓度和靶基因本身、细胞类型、siRNA效力、靶mRNA的半衰期等有很大关系。需要注意的是,在较低的siRNA浓度下,脱靶率通常最低。 主页的用量应根据siRNA浓度和培养皿规格进行调整,见表2。

 

注意:

1.转染前确认好 siRNA 的大小和纯度。

2.避免 RNase 污染,微量 RNase 就会导致 siRNA 实验失败。需要使用无RNase的耗材及试剂,保证实验每个步骤不受RNase污染非常重要。

 

 

1.2.1转染1nM siRNA的操作步骤

以下步骤用于在24孔板中转染1nM siRNA双链体,如使用其他规格的培养皿进行转染,可参见表2。

1)将0.6 pmoles(8.4 ng)的siRNA双链体稀释到100 μl无血清的培养基中或Opti-MEM中,用移液枪轻轻吹 3~5 次混匀

2)向上述100 μl 含siRNA的培养基中加入2μl 主页。

3)加入主页后立即涡旋振荡10秒钟,进行混匀。

4)在室温下孵育10分钟,使siRNA双链体和主页之间形成转染复合物,不要超过30分钟。

5)在转染复合物形成期间,吸弃培养皿中原有的培养基,并向每孔中重新加入0.5 ml预热的新鲜的完全培养基。

6)将步骤4中的100 μl转染复合物加入 24 孔细胞板中前后轻摇细胞板混合均匀。每孔中培养基的最终体积为600 μl,siRNA终浓度为1nM。

7)细胞板置于 37℃、5% CO2培养箱中培养

8)转染完成后 24~72 小时均可通过 qPCR Western Blot 进行 siRNA 沉默效果检测

 

表2.1nM siRNA时各种细胞培养容器的推荐转染条件

 

培养板规格

 

siRNA(pmoles)/孔

 

siRNA(ng)/孔

 

主页 体积

 

无血清培养基体积

 

完全培养基体积

 

总体积

96-well

0.17

2.4 ng

0.75 ± 0.5 µl

50 µl

125 µl

175 µl

24-well

0.6

8.4 ng

2 ± 1 µl

100 µl

500 µl

600 µl

12-well

1.2

17 ng

4 ± 2 µl

200 µl

1 ml

1.2 ml

6-well /3.5 cm

2.2

31 ng

8 ± 4 µl

200 µl

2 ml

2.2 ml

6 cm / 25 cm2培养瓶

4.4

62 ng

15 ± 5 µl

400 µl

4 ml

4.4 ml

10 cm / 75 cm2培养瓶

10.5

147 ng

40 ± 10 µl

500 µl

10 ml

10.5 ml

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1.2.2转染10nM ~50nM siRNA的操作步骤

 当siRNA浓度范围为10至50 nM时,请使用表3中所示的推荐条件。

 

 

表3.10至50nM siRNA时不同细胞培养容器中转染贴壁细胞的推荐条件

培养板规格

主页体积

无血清培养基体积

完全培养基

体积

总体积

96-well

1 ± 0.5 µl

50 µl

125 µl

175 µl

24-well

3 ± 1 µl

100 µl

500 µl

600 µl

12-well

6 ± 2 µl

200 µl

1 ml

1.2 ml

6-well / 3.5 cm

12 ± 4 µl

200 µl

2 ml

2.2 ml

6 cm / 25 cm2培养瓶

20 ± 5 µl

400 µl

4 ml

4.4 ml

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2、悬浮细胞转染siRNA操作步骤

2.1接种细胞

为了使用主页转染悬浮细胞取得最佳的转染效果,与常规培养条件相比,应在转染当天减少培养基体积接种细胞。对于不同规格的培养板,建议接种的细胞数量及完全培养基体积可参见表4。

表4.在转染当天接种的悬浮细胞的数量

培养板规格

接种细胞数量

培养基体积

384-well

5 000 - 10 000

25 µl

96-well

10 000 - 20 000

50 µl

24-well

100 000 - 200 000

200 µl

12-well

200 000 - 400 000

500 µl

6-well / 3.5 cm

500 000 - 2 x 106

1 ml

6 cm / 25 cm2 培养瓶

2 x 106 - 5 x 106

2 ml

 

2.2悬浮细胞转染

为了达到高的基因沉默效率,我们建议对siRNA浓度从5 nM至20 nM范围进行摸索,根据表5中所述的siRNA浓度,需要相应地调整主页的体积。

 

表5.根据siRNA浓度和培养板规格推荐使用的主页体积。

  siRNA 终浓度

    培养板规格

   主页体积

 

 

1 to 20 nM

384-well

1 ± 0.5 µl

96-well

2 ± 1 µl

24-well

3 ± 2 µl

6-well or 35 mm

10 ± 8 µl

 

 

20 to 50 nM

384-well

1.5 ± 0.5 µl

96-well

3 ± 1 µl

24-well

5 ± 2 µl

6-well or 35 mm

15 ± 8 µl

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

以下步骤用于在24孔板中转染5nM siRNA双链体,如使用其他规格的培养皿进行转染,可参见表6。

1)将1.5 pmoles(21 ng)的siRNA双链体稀释到100 μl不含血清的培养基中或Opti-MEM中,移液枪轻轻吹3~5 次混匀

2)向上述100 μl 含siRNA的培养基中加入4μl 主页。

3)立即涡旋振荡10秒钟,进行混匀。

4)在室温下孵育10分钟,使siRNA双链体和主页之间形成转染复合物,不要超过30分钟。

5)将步骤4中的100 μl转染复合物加入 24 孔细胞板中,每孔中细胞悬液为200 μl,前后轻摇细胞板混合均匀。每孔中培养基的最终体积为300 μl,siRNA终浓度为5 nM。

6)细胞板置于 37℃、5% CO2培养箱中培养

7)转染完成后 24~72 小时均可通过 qPCR Western Blot 进行 siRNA 沉默效果检测

 

表6.悬浮细胞中5nM的siRNA转染的推荐条件

培养板规格

siRNA(pmoles)/孔

siRNA(ng)/孔

主页体积/孔

无血清培养基/孔

细胞悬液体积

4-6小时后加入培养基的体积

384-well

0.25

3.75ng

1 ± 0.5 µl

25µl

25µl

0µl

96-well

0.5

7.5ng

2 ± 1 µl

50µl

50µl

100µl

24-well

1.5

21ng

3 ± 2 µl

100µl

200µl

0.7ml

12-well

3.5

49ng

6 ± 4 µl

200µl

500µl

1ml

6-well / 3.5 cm

6

84ng

10 ± 8 µl

200µl

1ml

2ml

6 cm / 25 cm2培养瓶

12

168ng

15 ± 10µl

400µl

2ml

4ml

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

3、 miRNA转染

在贴壁细胞中转染miRNA的操作步骤参见1.2;在悬浮细胞中转染miRNA的操作步骤参见2.2。

 

4、疑难解答

问题

解决建议

较低的沉默效率

增加每孔中siRNA浓度。

增加每孔中主页的量。

检测转染24h~96h的不同时间点的沉默效率。

用opti-MEM稀释siRNA。

确保贴壁细胞在转染当天汇合度达到30-50%。对于小细胞和生长缓慢的细胞类型,每孔中接种约2倍数量的细胞以达到足够的汇合度。

确认所有试剂是否不含RNase。

确保siRNA是高质量的(PAGE纯化和脱盐)。

确认siRNA双链体的浓度和退火条件。

将转染期间的培养基体积减少一半并低速离心培养板(180g,5分钟)。 4小时后,加入0.5毫升培养基。

细胞毒性

通过在转染后4至6小时更换培养基或简单地向培养基中添加新鲜培养基,减少主页/ siRNA复合物与细胞的孵育时间。

减少转染试验中使用的主页的体积。

核实沉默靶基因后是否不影响细胞活力。

 

Chinese, Simplified
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